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生命奥秘
力学生物学:分子力测量
发布时间:2017-5-9  来源:杭州科技交流馆  【字体大小:

细胞中的蛋白质结构无时无刻不在经历和创造着微小的力,而科学家正在学习如何在微观尺度上绘制这些力量。

新工具有助于揭秘引导胚胎发育和肿瘤生长等细胞过程的神秘力量。

在显微镜下,细胞通常是静态的,细胞是生物结构的固体元素。然而在现实中,细胞却是动态的结构,它们会在密闭环境中相互推搡。细胞会挤压、伸展、弯曲和拉动周围环境,并在这些过程中产生作用力。这些力是非常小的——大概在皮牛(10-9N)级别,大约只是一只回形针十分之一的重量。但它们可以产生深远的生物学影响。快速增长的胚胎中的力可以改变细胞的发育程序,告诉细胞何时停止分裂,并开始转化为脑或骨骼。

苏格兰科学家D'Arcy Thompson在《生长和形态》(On Growth and Form)一书中提出,物理力量影响细胞功能。他写道:“细胞和组织、壳和骨骼、叶子和花朵是物质的很多形式。因此它们遵循物理学的规律。”

Thompson的理论为力学生物学(Mechanobiology)的大量实验研究铺平了道路。德国慕尼黑马克斯-普朗克生物化学研究所(Max Planck Institute of Biochemistry)细胞力学研究者Carsten Grashoff指出,力学生物学是一个非常古老的领域,只是长时间被忽视了。在某种程度上,这是因为研究人员缺乏精确测量分子尺度力的技术。

但现在,情况大不相同,一些创新工具的问世为这些问题的研究奠定了基础。科学家们可以使用这些工具来绘制伤口愈合过程中,皮肤细胞向前爬行时,蛋白质的伸展和放松产生的力。但问题仍然存在——研究人员仍然很难从随机生物噪声中分辨出细胞力,而且还未确定这些过程在活体的复杂环境中如何发挥作用。但是,通过将“力学生物学”工具与其它遗传和生物化学工具结合起来,研究人员可以开始了解力如何被转化为功能。

加州斯坦福大学(Stanford University)机械工程师Beth Pruitt表示,生命过程不仅仅是生化信号通路。当你拉一个蛋白质时,你可以打开或关闭一个结合位点,决定细胞内的某个分子程序。

 

牵引力显微镜

细胞主要通过嵌入在细胞膜上的蛋白与环境相互作用,这是细胞力产生和解读的关键。一些蛋白质通过液体的流动而被“推”,如血管中细胞表面的蛋白质;而另一些蛋白质在细胞被邻近细胞碰撞时,或与邻近蛋白接触时,产生张力相关信号。

一种名为牵引力显微镜(traction force microscopy, TFM)的方法在20世纪90年代问世,并为该领域提供了第一个真正的、量化细胞力的工具。例如,1999年,当时在伍斯特马萨诸塞大学医学院(University of Massachusetts Medical School)的Yu-Li Wang和波士顿大学(Boston University)的Micah Dembo将一种名为成纤维细胞的结缔组织细胞接种到涂覆了荧光珠的凝胶状材料上。随后他们发现可以通过测量荧光珠的位移,使用TFM推断这些细胞产生的力。德国埃尔朗根-纽伦堡大学(Friedrich Alexander University of Erlangen-Nuremberg)的生物物理学家Ben Fabry指出,这就像是弹簧。你在弹簧上放置一个重物,只要已知弹簧的刚度,你就可以通过测量形变,算出重物的重量。

TFM已经成为研究单个细胞和组织样片中互相连接的细胞的标准方法。马里兰州贝塞斯达国家心脏肺血液研究所(National Heart, Lung and Blood Institute)的Clare Waterman使用TFM来研究细胞迁移。细胞迁移过程很大程度是由黏着斑(细胞和细胞外基质连接的媒介)与周围细胞外基质互动产生的力来推动的。

Waterman的团队增加了用于TFM成像的荧光珠数量,提高了图像的分辨率。她表示她们可以在每个黏着斑下放置50个标记,所以分辨率可以达到亚微米级别。Waterman的小组使用这种方法来研究粘着点产生的力如何触发分子事件,而这些分子事件在胚胎发育过程中协调定向细胞运动。

当然,响应细胞运动、多维度迁移的荧光珠远比单一维度变化的弹簧要复杂的多。尽管现代计算方法已经大大降低了这些数据的解读难度,但TFM还需要更强大的超级计算机来解读数据。即使有了超级计算机,将荧光珠位移数据转换成力测量并不容易,并且存在许多潜在错误的来源。Waterman指出,如果有另一个细胞反向拖动该荧光珠,那么看起来,该荧光珠就没有发生位移,没有受到力。另外,如果荧光珠的位移过大,超出了一个细胞的边界,那么就很难判断该荧光珠的原始位置。

其他团队将TFM扩展到三个维度,以更好地反映生物现实。例如,Fabry等人开发了一种在胶原蛋白(细胞外基质的主要蛋白成分)构成的凝胶上跟踪细胞力的3D TFM方法。该团队能够探索乳腺癌细胞的形状、细胞产生的力、在3D组织中移动的速度和方向之间的关系——模拟乳腺癌的转移过程。

但这一方法对分析和计算的要求非常高。Fabry指出,胶原蛋白是一种非常麻烦的材料——它的形变是非常非线性的。如果你稍微拉伸一下胶原蛋白,它还是柔性的;但如果你多拉伸一点,它就变成刚性的了。

为了解决这个计算负担,新泽西州普林斯顿大学(Princeton University)生物医学工程师Celeste Nelson在她的器官发育研究中选择了较低分辨率的方法。她们关注的是在数百或数千个细胞的整体中找到力量的相对差异。然而,力的产生本质上是动态的,因此需要在多个时间点收集这些3D数据,此时,数据处理就成了大问题。

 

微型阵列

另一些研究人员则另辟蹊径,选择使用各种聚合物模制的小型、精确设计的芯片,这些芯片可提供细胞力的直接读出。马萨诸塞州波士顿大学(Boston University)的生物工程师Christopher Chen等人开发了一种广泛使用的设计——一种称为PDMS组成的弹性材料。该材料商有一系列柔性小柱子,就像牙刷上的刷毛。这些“微柱”顶端涂覆了ECM蛋白质,以便与细胞形成连接。Chen表示,这些微柱基本上就像迷你弹簧一样。Chen实验室的前博后、现在在密西根大学(University of Michigan)大学使用类似芯片研究人类干细胞的Jianping Fu指出,通过测量偏差,研究者可以识别和测量细胞在单个支柱上施加的力。

 

 

力学生物学:分子力测量2

芯片上微柱的歪斜是可测量的,并可与细胞蛋白质支架进行比较。

 

 

微型阵列数据比TFM实验的结果更容易解读,并且需要的计算分析相对少。而且这种芯片的生产也相对简单。并且微型阵列也与荧光显微镜兼容,这有助于从分子层面研究产生细胞力的事件。然而,这些阵列强化了细胞与其底物之间的特异和非自然的相互作用模式。这些相互作用模式取决于微柱的分布和尺寸,并且可能和细胞在活体内的作用模式大不相同。

研究人员还可以通过操纵微柱阵列的设计来定制微柱表面。微柱越粗,越牢固;微柱越高,越细,对力的反应更为敏感。微柱表面的刚度变化可以引发细胞骨架(细胞中的蛋白纤维网架体系,帮助细胞传递和响应力)的大量重组。这又可以影响细胞的增殖、运动和成熟。

例如,Fu发现,表面刚性与成体干细胞分化之间存在关系。树桩一样的微柱难以弯曲,但附着其上的干细胞趋向于分化成骨细胞。如果微柱非常高,那么附着其上的干细胞倾向于分化成脂肪细胞。通过精确调控设计,Fu的团队神值可以开发出一种诱导人类胚胎干细胞发育成功能性脊髓运动神经元的微型阵列。

 

微小拉力

其他研究人员则使用张力发生变化时发出荧光信号的分子传感器来研究蛋白质或蛋白质复合物施加的力。这种传感器通常基于Förster共振能量转移(Förster resonance energy transfer, FRET)原理,其中一个荧光分子或荧光团激发另一个荧光团——但仅当它们非常接近时。

 

 

力学生物学:分子力测量3

迁移中细胞施加的牵引力图谱。

 

Grashoff是夏洛茨维尔大学(University of Virginia)生物医学工程师Martin Schwartz实验室的博士后。他与同事一起开发了第一个基于FRET的张力传感器,该论文于2010年发表。Grashoff等人想到,可以使用蜘蛛丝中的那种弹性蛋白,把两个荧光团连在一起。当有机械张力时,该蛋白会伸长,释放的FRET信号就会减少。未受到拉力时,该弹性蛋白质会形成一个紧凑的线圈,但任何轻柔的拉力都可以拉伸该蛋白,并将两个荧光团分开。

作为概念证明,Grashoff和Schwartz用他们的传感器研究黏着斑蛋白(负责连接细胞骨架与细胞外基质的黏着斑的成分之一)。当细胞中表达传感器蛋白时,他们观察到,在细胞迁移过程中,随着黏着点的组装和分解,黏着斑蛋白受到皮牛尺度的力变化。

原则上,FRET传感器可以插入到不同的蛋白质中,以获得其它难以收集的测量结果。例如,目前几乎没有工具可以量化细胞在组织中彼此推动和拉动的力。斯坦福大学(Stanford University)化学工程师Alexander Dunn等人通过将Grashoff和Schwartz的FRET传感器整合到上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin是将细胞连接在一起的蛋白质)中来测量这些力。

FRET传感器也可以整合到其它连接蛋白质中,同时也使研究人员能够微调传感器的灵敏度。Grashoff指出,他的FRET传感器可以选择性地检测1-12个皮牛的力,但仍有改进的余地,因为细胞内蛋白质可能会受到高达20-30皮牛的力。

但是这种传感器的设计和验证是劳动密集型的。除了力检测之外的原因(如降解),传感器可能会“变暗”。FRET信号也可能具有挑战性,需要仔细测量以消除噪声,并且将大体积的传感器植入到功能强烈依赖于结构的蛋白质中,会有一定的影响,因为这样可能会影响蛋白的功能。Grashoff表示,你很难预测植入到蛋白中的效果,传感器干扰了蛋白功能可能不是大问题,但前提是,你要知道干扰有多大。

其他团队使用不需要植入到蛋白质中的传感器来测量细胞外力。佐治亚州亚特兰大埃默里大学(Emory University)生物物理学家Khalid Salaita的团队研发了几种这样的探针,其中一端固定在固体表面上,如载玻片,另一端则与感兴趣的细胞表面蛋白连接。在探针这一端和蛋白之间还有各种各样的连接分子,对不同程度的力作出响应。Salaita指出,聚乙二醇聚合物就像煮过的意大利面条,随便一个卷曲都可以被拉伸,而DNA也具有这种固定的二级结构(螺旋式结构)。

他的小组还使用了一种衍生自肌联蛋白(高度弹性的分子,在肌肉中产生弹性的卷曲)的连接分子。Salaita表示,这个传感器就像是一个自然衍生的、能承受更大力的弹簧。这些基于肌联蛋白的传感器足够强大,可以测量细胞通过整合素蛋白(黏着斑中可以产生几十皮牛的成分,几十皮牛足以打断脆弱的DNA双链和聚合物类的感应器)对其环境产生的拉力。整合素基本上是一种强力抓钩,可以让细胞对周围环境产生巨大的力。

 

临床意义

检测细胞内的力本身就是一个大成就。Salaita认为,在单细胞水平测量力可以帮助科学家开发更直接干扰肿瘤进展的物理机制的药物。他还指出,癌细胞的迁移和入侵是最致命的,如果你可以关闭癌细胞迁移的机械过程,同时保证药物无细胞毒性,那么这就是一种更精准的肿瘤治疗方法。

然而,许多生物学问题需要在组织或器官尺度上进行探索。Nelson认为,通过离体细胞来预测组织非常困难,但单个细胞的连接对组织中的力的产生和传递是必要的。

在她的许多实验中,Nelson使用工程化上皮组织,为研究器官形成所涉及的力提供了可控的、可重现的模型。其他团队则使用干细胞产生专门的组织;例如,Pruitt使用干细胞分化得到的心肌细胞来研究心脏病的机械生物学作用。Nelson表示,我们有这样的工具,可以从人类细胞中产生心肌细胞,并在单细胞和微量组织中应用和测量力、位移和伸展。

不过目前的工具还远远不够。大多数力测量实验仍然非常耗时,这限制了其在需要对大量细胞进行并行分析的研究(例如药物筛选)中的应用。Fabry的团队正在开发自动化和加速TFM的方法。他们想同时测量3D组织中数百或数千个细胞的响应。

测量生物体内的细胞力也是一个重大挑战。FRET传感器是一种解决方案,加州大学圣巴巴拉分校(University of California, Santa Barbara)的机械工程师OtgerCampàs等人最近设计了另一种解决方案。他们往生物体组织中注射荧光标记油滴,油滴中含有与细胞表面结合的蛋白质。通过记录这些液滴在细胞之间的空间中的变形情况,便可以计算导出细胞在液滴上施加的3D力。

也许最根本的是,需要一些实验技术,使科学家更精确地操纵力响应分子。例如,灭活单个黏着点的能力与遗传学家敲除单个基因的方式类似,可以揭示分子力在时间和空间上的分布状态如何改变它对细胞的影响。Nelson指出,这可以让他们直接回答很多现在还无法解答的问题。

 

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